醫(yī)院藥學(xué)/毒性實驗法
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（一）概述 某一種新藥或一個的制劑，于臨床使用前，必須經(jīng)過這個步驟。雖然藥物對人的作用，不完全能在動物身上表現(xiàn)出來，但對一個藥物來說仍是一個很有用的參考數(shù)據(jù)。因此，為保證病人的用藥安全，新藥在臨床應(yīng)用前一定要進(jìn)行毒性試驗。毒性試驗的類型，可根據(jù)藥物的性質(zhì)及使用途徑、方法和時間等加以選擇。如有的藥物后則產(chǎn)生中毒癥狀；有的藥物需長期服用才能秦效等。因此，藥物的毒性試驗，應(yīng)根據(jù)該藥物的特點來決定。
（二）急性毒性試驗（一般安全試驗）取體重18-22g的健康不白鼠5只，由尾靜脈（或腹腔）注射一定劑量的藥液（容量以0.5ml為宜，可用注射生理水稀釋成不同濃度），注射時間為4-5秒，觀察有無不良反應(yīng)（如驚厥、四肢癱瘓、步伐不穩(wěn)、豎毛、呼吸抑制等）或死亡。主要以死亡為指標(biāo)，注射后48小時內(nèi)不得有死亡。如有死亡應(yīng)加取小白鼠10只重新試驗，全部小白鼠在48小時內(nèi)不得有死亡（做過本試驗的小白鼠不得重復(fù)使用）。
【注】①供試品靜脈有困難時，可由腹腔注射，注射量仍為0.5ml，注射時間不限，注射后72小時內(nèi)不得有死亡。
②若某一藥物無安全試驗劑量時，可將臨床人用劑量乘以一定的安全系數(shù)然后再折算成小白鼠體重的劑量。安全系數(shù)大小，應(yīng)根據(jù)該藥物的純度及臨床試驗情況而定，一般治療性藥物可定為50－100，需長期服用的藥物可為100以上。
例：某注射液，成人（按體重50kg計），每次注射量為4ml，安全系數(shù)為50，則小白鼠（按20g計）的給藥劑量為：
小鼠劑量＝4×50／50000×20＝0.08ml
取該藥0.08ml加0.9％氯化注射液稀釋成0.5ml，作為供試品的注射用量。
③也可用同樣方法試驗（即某一劑量注入小白鼠內(nèi)，若5只中只有1只死亡，則減劑量再試直至試出5只小白鼠均不死亡的最大劑量）。求出某藥物的安全系數(shù)。
計算公式：
安全系數(shù)＝小白鼠最大耐受量×成人體重（g）／成人用量×小白鼠體重（g）。
例：某藥特的劑量為4ml，當(dāng)劑量為0.2ml（稀釋至0.5ml），給小白鼠靜脈注埋時引起死亡，減劑量再試，在0.16ml/20g時，沒有反應(yīng)，故含有苯甲醇的注射劑，對試驗往產(chǎn)生干擾，應(yīng)引起注意。
④苯甲醇對小白鼠有一定毒性反應(yīng)，故含有苯甲的注射劑，對試驗結(jié)果往往產(chǎn)生干擾，應(yīng)引起注意。
（三）亞急性和慢性試驗 需要較長期投用的藥物，應(yīng)做亞急性或慢性毒笥試驗。方法和急性毒性試驗基本相同，按小白鼠體重計算，每在在口服或腹腔注射劑量為人用劑量的20－50倍，連續(xù)用藥1－8周。慢性毒性，連續(xù)用3-6個月。在用藥期間，應(yīng)仔細(xì)觀察試驗動物的體重、進(jìn)食量、進(jìn)水量的變化，以及有無不良反應(yīng)或死亡。動物在試驗前后，均應(yīng)做血象、肝、腎等功能檢查，以資對照。試驗中死亡或試驗完畢的動物都要做解剖，觀察內(nèi)臟器管和組織切片檢查。根據(jù)試驗結(jié)果，判斷可否用于臨床。
【注】①亞急性，慢性毒性試驗，均應(yīng)設(shè)對照。這是由于的飼養(yǎng)環(huán)境和健康情況的不同個體差異往往很大，給藥后內(nèi)臟的變化如無空白對照組做比較，常使實驗結(jié)果難以判斷。
②非經(jīng)口服的藥品，應(yīng)注意須滅菌后作用，以免動物被染而影響結(jié)果。
③毒性實驗的給藥途徑，應(yīng)盡量采用與臨床應(yīng)用的相同方法。給藥途徑不同毒性表現(xiàn)常是差別很大，如口服給藥的LD50比靜脈或腹腔注射的LD50大幾十倍。
④毒性實驗前，實驗設(shè)計要考慮周密，應(yīng)盡力避免實驗中臨時改變條件。實驗用的動物，一般應(yīng)在本實驗室條件下2周以上，使動物適應(yīng)環(huán)境后，再進(jìn)行實驗。
⑤實驗室要注意加強(qiáng)對動物的管理，保持清潔衛(wèi)生。對實驗中途死亡的動物應(yīng)做出客觀的分析，以便正確總結(jié)判斷。
⑥毒性實驗中，除記錄計量指標(biāo)外，支動物的一般狀態(tài)如興奮、抑制、麻痹、呼吸、食欲、體重等應(yīng)進(jìn)行仔細(xì)地觀察、對實驗中藥物出現(xiàn)作用的時間，速度以及毒副作用的特點等，均應(yīng)嚴(yán)密觀察，并詳細(xì)記錄，以便進(jìn)行綜合分析。
⑦在亞急性、慢性毒性實驗中，應(yīng)根據(jù)藥物的性質(zhì)和實驗要求的不同，在給藥前后以及實驗時，對實驗動物易發(fā)生毒性反應(yīng)的主要器官進(jìn)行檢查。檢查項目有：
A血象：包括血色紅素、紅、白細(xì)胞及分類計數(shù)等。
B肝功能：肝臟是機(jī)體重要的代謝器官，不僅對糖、蛋白質(zhì)及脂類代謝起得要作用，也是許多藥物在體內(nèi)的解毒場所，故應(yīng)進(jìn)行肝臟功能的檢查。
C腎功能：大部分藥物從腎臟排泄，故應(yīng)測定藥物對腎功能有無損害及其損害的程度，其中包括血中非蛋白氮含量，小便常規(guī)檢查。
D組織切片：可進(jìn)一步了解藥物對各臟器有無損害及其損害的程度?？蓪游镌诓煌钠趦?nèi)分批處死、取其心，肝、脾、肺腎、胃、腸等進(jìn)行切片檢查，并與對照比較，觀察藥物對各組織有無可逆或不可逆損害。
（四）半數(shù)致死量的測定 半數(shù)致死量（簡稱LD50）是指藥物引起實驗動物半數(shù)死亡的劑量。由于個體差異，同一劑量的藥物給同一動物，可以出現(xiàn)死亡或不死亡。而LD50在表示藥物毒性時，比較靈敏，準(zhǔn)確。一般以每kg多少mg表示（藥物劑量／體重）
測定LD50常用動物為小白鼠，體重18-22g，雄雌均可（雌的不得懷孕）將不同性別和體重的動物均勻分成4或6組，每組10只。 給藥途徑和臨床應(yīng)用相同，給藥容量以0.5ml為宜。一般觀察3天，以死亡為主要指標(biāo)。
1．機(jī)率單位比例法 精密稱取適量的檢品（如系溶液可精密量取），按等比級數(shù)（0.1、0.3、0.9……）或等差級數(shù)（0.1、0.2、0.3……）配成4種或6種濃度，分 別用于4組或6組小白鼠，觀察在一定時間內(nèi)死亡情況，找出使小白鼠死亡數(shù)在50％以上和50％以下的兩個劑量（如各組小白鼠均無死亡或全死亡則表示劑量選擇不當(dāng)，須更換較高或料低劑理重試），按下列公式計算出半數(shù)致死量。
M＝高劑量的對數(shù)值
N＝低劑量的對數(shù)值
A＝高劑量所致小白鼠死亡百分率（大于50％）的機(jī)率單位
B＝低劑量所致小白鼠死亡百分率（小于50％）的機(jī)率單位
5＝50％死亡百分率的機(jī)率單位
例：烏頭堿注射液急性毒性試驗結(jié)果。見下表。
烏頭堿注射液急性毒性試驗結(jié)果
|
劑量(mg/kg) |
劑量對數(shù)值 |
死亡百分率 |
機(jī)率單位 |
|
29.50 |
1.4698 |
90 |
6.28 |
|
23.75 |
1.3756 |
40 |
4.7 |
LD50=24.60mg/kg
2．簡化機(jī)率單位法
（1）劑量預(yù)試：取小白鼠9只，均分3組，將被試藥物分大中小3個劑量，每個劑量各給1組動物觀察一定時間的死亡情況。如3組全死或全不死，應(yīng)重新選擇劑量再試，二至找到死亡率大于和小于50％的劑量。
（2）正式試驗：取18-22g的健康小白鼠，雌雄兼有，按體重、性別均勻分組，每級10只。將預(yù)試中的找到的劑量范圍按等比級數(shù)分成2-4個劑量（須有使動物死亡率大于50％和小于50％的兩種劑量），劑量間的比例范圍內(nèi)為宜。每個劑量各給1組動物。給藥生觀察3天（有的可延長到7天），記錄動物的一般狀態(tài)和死亡數(shù)目。根據(jù)各劑量的組的死亡率，簡化機(jī)率單位求出LD50，其分工如下：
式中I為相鄰兩劑量比值（高劑量分子）的對數(shù)：y為各組死亡率相應(yīng)的機(jī)單位；y為各機(jī)率單位的平均數(shù)；X1為小劑量的對數(shù)值。
【注】用本法則定藥物的LD50，在一般情況下采用兩組即可，將實驗果代入分組時的公式中求出。分組、4組皆可，分組多，用動物多，計算復(fù)雜，但更準(zhǔn)確。
例：某新藥，要測定對小白鼠口服給藥的LD50，首先進(jìn)行劑理預(yù)試，將該藥物先分為700、800和1000mg/kg3種劑量，每劑量給3只小白鼠灌胃，觀察2天，結(jié)果700 mg/kg組死亡1只，800 mg/kg組殘廢只，1000 mg/kg組全部死亡。這樣，就找到了死亡率小于50％的劑量為700 mg/kg；大于50％的劑量為800和1000 mg/kg，依上述情況。估計用670和800 mg/kg可使動物死亡20％ 和60％左右，兩組劑量之比670／800為0.84。符合本法劑量比值范圍的要求。若分組時用此兩劑量可以實驗；若用3組時，可按同樣的劑量比求出第三組劑量，即800／0.84＝952。這樣，670、800和952 mg/kg3個劑理組即成等比級數(shù)，其中每相鄰兩劑量比均為0.84。然后各劑量的組均給10只動物，觀察3天，記錄動物的一般狀態(tài)和死亡情況，結(jié)果如下表：
LD50實驗觀察表
|
組別 |
劑量（mg/kg） |
劑量對數(shù)（X） |
鼠數(shù) |
三天內(nèi)死亡數(shù) |
死亡率（％） |
機(jī)率單位(y) |
機(jī)率單位平均值(y) |
兩劑量比值的對數(shù)（i） |
|
1 |
670 |
2.8261 |
10 |
2 |
20 |
4.16 |
||
|
2 |
800 |
2.9031 |
10 |
8 |
70 |
5.52 |
5.32 |
0.77 |
|
3 |
952 |
2.9786 |
10 |
9 |
90 |
6.28 |
本實驗分組。故代入分組時的計算公式：
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