基因轉(zhuǎn)移
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最常用的將克隆重組的DNA片段導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法是用磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的DNA可能是通過吞飲作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后進(jìn)行細(xì)胞核。
（1）配制下列溶液
①2×HEPES-緩沖鹽溶液（HBS）
②2mol/L CaCl2
③0.1×TE(pH8.0)用0.22μm濾器過濾除菌，分裝貯存于4℃。
④DNA：將DNA（約20μg/106細(xì)胞）溶于0.1×TE（pH8.0），使用濃度為40μg/ml。為使轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，質(zhì)粒DNA應(yīng)用CsCl-溴化乙錠密度梯度平衡離心法純化。如果所用DNA量較少，應(yīng)加入載體DNA將DNA濃度調(diào)至40μg/ml。實(shí)驗(yàn)室制備的真核載體DNA轉(zhuǎn)染效率通常要比商品化的牛胸腺DNA、鮭魚精DNA高。載體DNA用前應(yīng)通過乙醇沉淀或氯仿抽提進(jìn)行滅菌。
（2）轉(zhuǎn)染前24h用胰蛋白酶進(jìn)行消化以獲得對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以1～2×105細(xì)胞/cm2的密度重新種入60mm組織培養(yǎng)皿中。在37℃、5%～7%CO2及一定濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24h。
（3）每轉(zhuǎn)染一個(gè)mm培養(yǎng)皿中的單層細(xì)胞，須依如下方法制備磷酸鈣-DNA共沉淀物：取步驟一所制備的DNA［40μg/ml，溶于0.1×TE(pH8.0)］220μl,2×HBs 250μl,放入一次性使用的滅菌5ml塑料管中，緩慢加入31μl 2mol/l 氯化鈣（溫和混合30s左右）。于室溫育20～30min，其間將形成細(xì)小沉淀。溫育結(jié)束時(shí)，用吸管將混合液吹打一次，使沉淀物懸浮。
通常采用的另一方案是將氯化鈣和DNA的稀釋混合液加入2×HBS溶液中，逐滴加入并小心混合250μl按步驟一制備并溶于氯化鈣（250mmol/L）的DNA。按照前述方法溫育之。
如果需要轉(zhuǎn)染更為大量的細(xì)胞，上述兩種反應(yīng)混合液的體積均可翻一番或翻兩番。如果體積翻兩番，則須使用更大的塑料管，一般在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上，可將0.5ml磷酸鈣-DNA共沉淀物加入5ml培養(yǎng)液中，而在90mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上，一般將1ml沉淀物加入10ml培養(yǎng)液中。
已經(jīng)發(fā)表的方案中，混合各組分的方式與速率大不相同。其中有一些認(rèn)為除了溫和振搖之外，其它措施均無濟(jì)于事，并建議用電動(dòng)移液裝置吹出的空氣來混合溶液。其它一些方案則規(guī)勸在加入DNA溶液時(shí)連續(xù)而緩慢地混勻，然后再溫和振蕩。其目的是為了避免急速形成粗沉淀物，以致降低轉(zhuǎn)化效率。實(shí)際上，除了混合的速度之外，還有其它若干因素包括DNA的濃度和大小（讓高分子量DNA從細(xì)針頭中通過，可將之剪切變?。?、緩沖液的精確pH（有些工作者配制了幾批pH范圍從6.95至7.1不等的HBS緩沖液，逐批試驗(yàn)沉淀物的質(zhì)量及轉(zhuǎn)染效率）。如果必須使轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高，就要花時(shí)間針對(duì)特定的系統(tǒng)優(yōu)化上述幾種因素。一旦得到一批靈驗(yàn)的試劑，只需依照前面方法進(jìn)行配制和貯存，即可在長期內(nèi)獲得可重復(fù)的結(jié)果。
（4）將磷酸鈣-DNA懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞單層上的培養(yǎng)液中［在60mm培養(yǎng)皿中，可將0.5ml懸液加入5ml培養(yǎng)液中］，輕輕左右晃動(dòng)一下培養(yǎng)皿使培養(yǎng)液得以混合，此時(shí)可見培養(yǎng)液成黃橙色渾濁狀。另一方法是吸出培養(yǎng)液，直接把沉淀物加到細(xì)胞上，將細(xì)胞置于室溫溫育15min，然后再將培養(yǎng)液加回到培養(yǎng)皿中，此時(shí)細(xì)胞上有許多細(xì)小顆粒。采用以上兩種方法，都要在37℃、5%～7%CO2及一定濕度的培養(yǎng)箱中將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)長達(dá)24h［時(shí)間的長短取決于后續(xù)處理步驟的不同，見步驟（5）］。
（5）然后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞可依以下任一種方法處理：
①如果不進(jìn)行其它處理（如用氯喹、甘油或丁酸鈉等試劑處理，見后），可在細(xì)胞培養(yǎng)16～24h后，吸出培養(yǎng)液和沉淀物，用PBS將單層細(xì)胞再洗一次。然后按下述③d操作。
②在許多情況下，同時(shí)用氯喹處理細(xì)胞，可提高DNA攝入率。氯喹可能是通過抑制溶酶體水解酶類對(duì)DNA的降解而起作用的。氯喹濃度及其處理時(shí)間不能超越細(xì)胞對(duì)其毒性作用的耐受能力。因此必須通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來決定適于所用特定型別細(xì)胞的最佳氯喹濃度。但對(duì)于大部分型別的細(xì)胞，用終濃度為100μmol/L的氯喹處理3～5h，都可取得良好效果。可在磷酸鈣-DNA共沉淀物加入細(xì)胞之前或之后（見步驟（4）介紹的其它方法），直接將氯喹二磷酸貯存液（過濾除菌并貯于-20℃用金屬泊密封的管中，100mmol/L）稀釋（1：100）于培養(yǎng)液中。在氯喹處理過程中，細(xì)胞呈現(xiàn)泡狀是正常的。經(jīng)用DNA和氯喹處理3～5h后，棄去培養(yǎng)液和沉淀，用PBS洗，然后按下述d操作。
③用甘油短暫處理細(xì)胞，同樣可提高轉(zhuǎn)化效率或?qū)隓NA的瞬時(shí)表達(dá)水平。這一步驟可以在氯喹處理之后進(jìn)行。由于不同細(xì)胞對(duì)甘油的毒性作用的敏感性相差懸殊，因此每種型別的細(xì)胞都必須通過預(yù)實(shí)驗(yàn)決定最佳處理時(shí)間（從30s至3min）。耐受甘油的細(xì)胞可以暴露于含磷酸鈣-DNA共沉淀物（含或不含氯喹）的生長液3～5h后進(jìn)行休克。
a. 吸出生長液，用PBS將單層細(xì)胞洗1次；
b.在單層細(xì)胞中加入1.5ml溶于1×HBS的15%甘油，在37℃培養(yǎng)0.5～3min；
c.吸出甘油，用PBS將單層細(xì)胞洗1次；
d.加入5ml預(yù)加溫的完全生長液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24～60h后，檢測(cè)DNA的瞬時(shí)表達(dá)或?qū)⒓?xì)胞重新種入適當(dāng)?shù)?a href="/w/%E9%80%89%E6%8B%A9%E6%80%A7%E5%9F%B9%E5%85%BB%E5%9F%BA" title="選擇性培養(yǎng)基">選擇性培養(yǎng)基中，分離穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。
④業(yè)以表明，丁酸鈉也可以在猴源和人源細(xì)胞中增強(qiáng)帶SV40早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的重組質(zhì)粒的表達(dá)?？芍苯釉谏L液中加入有關(guān)試劑，也可以使經(jīng)過甘油休克的細(xì)胞接受丁酸鈉處理。須視細(xì)胞型別的不同，采用不同濃度的丁酸鈉（500mmol/L貯存液，在化學(xué)通風(fēng)櫥中用NaOH中和丁酸制備而成），例如：
CV-1 10mmol/L
NIH-3T3 7mmol/L
HelaS3 5mmol/L
CHO 2mmol/L
不加完全生長液，然后重復(fù)步驟d。
（6）轉(zhuǎn)移基因表達(dá)和細(xì)胞集落形成
①瞬時(shí)表達(dá)：在轉(zhuǎn)染后48～60h收獲細(xì)胞，進(jìn)行RNA或DNA雜交分析。新合成的蛋白質(zhì)可以用放射免疫測(cè)定Western印跡，體內(nèi)代謝標(biāo)記－免疫沉淀或者細(xì)胞提取液中酶活性的測(cè)定等方法來進(jìn)行分析，如果測(cè)定中有重復(fù)品或者轉(zhuǎn)染細(xì)胞要經(jīng)過多種不同條件或在一段時(shí)間歷程以內(nèi)取不同時(shí)間進(jìn)行處理，就要避免皿與培養(yǎng)皿之間轉(zhuǎn)染效率的偏差。在這些情況下，最好轉(zhuǎn)染大片的單層細(xì)胞（90mm培養(yǎng)皿），培養(yǎng)24h后用胰蛋白酶進(jìn)行消化，再分接到若干較小的培養(yǎng)皿上。
②穩(wěn)定轉(zhuǎn)化：在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24h，使所轉(zhuǎn)移基因得到表達(dá)之后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，種入適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基中。這種培養(yǎng)基在2～3周內(nèi)每2～4d須更換1次，以便除去死細(xì)胞殘骸并使抗性細(xì)胞集落得以生長。
可以克隆單個(gè)細(xì)胞集落，增殖后進(jìn)行測(cè)定。可以用冰預(yù)冷的甲醇將仍保留在培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞固定15min，再于室溫用10%Giemsa染色15min，最后用自來水沖洗，這樣即可得到細(xì)胞集落數(shù)的永久記錄。Giemsa染液可用PBS或水現(xiàn)用現(xiàn)配，并用Whatman 1號(hào)濾紙過濾。
重新接種細(xì)胞以便取得分隔良好的細(xì)胞集落所要求稀釋倍數(shù)，主要由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的效率來決定。這一效率可以相差若干個(gè)數(shù)量級(jí)，它起決于：a.受體細(xì)胞的型別（即使同一細(xì)胞系，克隆不同或傳代數(shù)不同，也表現(xiàn)出顯著差異）；b.導(dǎo)入基因的特性及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號(hào)強(qiáng)弱；c.轉(zhuǎn)染中所用供體DNA的量。
基因轉(zhuǎn)移是用物理的、化學(xué)的或生物學(xué)的方法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞并使之表達(dá)的一種技術(shù)。物理方法包括顯微鏡注射法、電脈沖介導(dǎo)法。顯微注射法是應(yīng)用特別的玻璃顯微注射器在顯微鏡下把重組DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞；電脈沖介導(dǎo)法又稱電穿孔法，是指在高壓電脈沖的作用下，使細(xì)胞膜上出現(xiàn)瞬間微小的孔洞，從而介導(dǎo)不同細(xì)胞之間的原生質(zhì)膜發(fā)生融合，使外源DNA通過細(xì)膜上出現(xiàn)的瞬間小孔而進(jìn)入細(xì)胞?；蜣D(zhuǎn)移的化學(xué)法有DNA-陽離子-二甲基亞砜法。基因轉(zhuǎn)移的生物學(xué)方法包括細(xì)胞融合法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、原生質(zhì)體融合法等。除以上三種方法外，又出現(xiàn)了顆粒轟擊技術(shù)，就是將外源DNA包被在金屬上，在電場(chǎng)中包被DNA的金屬顆粒獲得能量并以高速度運(yùn)動(dòng)，穿入靶細(xì)胞組織或器官內(nèi)，由于這種金屬顆粒可以涂成薄膜狀，所以可實(shí)現(xiàn)較多細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移同時(shí)發(fā)生，改進(jìn)了其它物理方法基因轉(zhuǎn)移效率低的缺點(diǎn)。盡管物理法、化學(xué)法及生物學(xué)法在基因轉(zhuǎn)移中被廣泛應(yīng)用，但由于基因轉(zhuǎn)移效率較低，在短時(shí)間內(nèi)難以取得基因治療所需要的108~1012個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，因而在基因治療的應(yīng)用中仍然具有一定局限性，雖然對(duì)其進(jìn)行了一些改造，如顆粒轟擊技術(shù)的處理和應(yīng)用，但也不能完全克服以上缺點(diǎn)，故而在基因治療中不得不救助于其它技術(shù)，目前被廣泛應(yīng)用的一種技術(shù)就是逆轉(zhuǎn)病毒載體技術(shù)（RMGT）。
逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因技術(shù)，是目前將外源基因導(dǎo)入細(xì)胞的最有效的方法。此系統(tǒng)包括重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和包裝細(xì)胞兩個(gè)部分，廣泛應(yīng)用的逆病毒載體LNL6是以Moloney鼠白血病病毒（MO-MLV）改建的。該病毒為RNA病毒，感染細(xì)胞后，其基因組RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)產(chǎn)生雙鏈DNA拷貝插入宿主染色體形成前病毒，前病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生正鏈即為病毒基因組RNA。整個(gè)基因組從5′端到3′端依次是：5′長末端重復(fù)順序（LTR）編碼病毒內(nèi)部結(jié)構(gòu)蛋白的gag基因，編碼蛋白的pol基因，編碼外殼蛋白的env基因以及3′LTR和一個(gè)介子5′LTR和gag基因之間的包裝信號(hào)。將病毒蛋白編碼區(qū)gag、pol、env全部切除，代之以外源性目的基因即改建為病毒載體，保留了LTR和包裝信號(hào)，是一種復(fù)制缺陷性病毒。同時(shí)，設(shè)計(jì)一種包裝細(xì)胞系，其內(nèi)含有輔助病毒基因組，即為包裝信號(hào)缺乏的MO-MLV。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)入包裝細(xì)胞系時(shí)，載體基因就被包裝形成完整的病毒顆粒，于是包裝細(xì)胞系就成了制造病毒載體的生產(chǎn)細(xì)胞系。將靶細(xì)胞與生產(chǎn)細(xì)胞系其同培養(yǎng)或是收集含有載體病毒的生產(chǎn)細(xì)胞系上清液與靶細(xì)胞一起孵育，即可有效地進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于轉(zhuǎn)染譜廣，可感染包括人體在內(nèi)的多種動(dòng)物細(xì)胞類型，一次可感染大量細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率高達(dá)100%，轉(zhuǎn)染的基因可為單拷貝和少數(shù)拷貝，能準(zhǔn)確地整合到宿主細(xì)胞基因組中，整合率高，且能長期有效地表達(dá)。RMGT仍有不足之處：①載體的滴度較低；②是輔助病毒與載體病毒重組重新獲得包裝信號(hào)使病人面臨感染輔助病毒的危險(xiǎn)性；③此載體只能整合至分裂相細(xì)胞；④此載體容納的外源基因量較少，不利于較大的基因的插入。因此，人們?cè)谂Ω脑彀b細(xì)胞系使其日趨完善，并廣泛用于體外及體內(nèi)的基因治療中。在體外治療中，為了增強(qiáng)腫瘤病人骨髓細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，將骨髓細(xì)胞和帶有mdrI基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒在體外共同培養(yǎng)后回輸體內(nèi)，獲得了很高的療效；在體內(nèi)治療中，用HSV-tk基因構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染成纖維細(xì)胞后被直接注入鼠腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，再給予GCV治療，轉(zhuǎn)染了HSV-TK基因的膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)GCV的易感性使得腫瘤完全消退了，目前，這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的臨床應(yīng)用階段尚未報(bào)道。
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