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DNA復(fù)制

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DNA復(fù)制是指DNA雙鏈在細(xì)胞分裂分裂間期進(jìn)行的以一個(gè)親代DNA分子為模板合成子代DNA鏈的過(guò)程。復(fù)制的結(jié)果是一條雙鏈變成兩條一樣的雙鏈(如果復(fù)制過(guò)程正常的話),每條雙鏈都與原來(lái)的雙鏈一樣(排除突變等不定因素)。

DNA復(fù)制是一種在所有的生物體內(nèi)都會(huì)發(fā)生的生物學(xué)過(guò)程,是生物遺傳的基礎(chǔ)。對(duì)于雙鏈DNA,即絕大部分生物體內(nèi)的DNA來(lái)說(shuō),在正常情況下,這個(gè)過(guò)程開始于一個(gè)親代DNA分子,最后產(chǎn)生出兩個(gè)相同的子代DNA分子。親代雙鏈DNA分子的每一條單鏈都被作為模板,用以合成新的互補(bǔ)單鏈,這一過(guò)程被稱為半保留復(fù)制。細(xì)胞校正機(jī)制確保了DNA復(fù)制近乎完美的準(zhǔn)確性。

在細(xì)胞當(dāng)中,DNA復(fù)制起始于基因組的特殊位點(diǎn),稱為“起始位點(diǎn)”。起始于起始位點(diǎn)的DNA解鏈和新鏈的合成會(huì)形成復(fù)制叉。除了DNA聚合酶外,一些酶通過(guò)添加和模板相配的核苷酸來(lái)合成新DNA,一些和復(fù)制叉連接的其他蛋白對(duì)DNA的復(fù)制起始和延伸起輔助作用。

DNA復(fù)制也可以在體外(即人工地)進(jìn)行,從細(xì)胞中分離的DNA聚合酶和人造的DNA復(fù)制引物可以用來(lái)啟動(dòng)以已知序列的DNA分子為模板的復(fù)制,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種常見的實(shí)驗(yàn)室技術(shù),這種采用了循環(huán)方式的人工合成,在一個(gè)DNA池中擴(kuò)增出特定的DNA片段。

DNA復(fù)制

此時(shí),原本呈雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈已經(jīng)打開,并且每一條單鏈都作為下一條新鏈的模板。各個(gè)核苷酸按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則被合成新的堿基對(duì)

目錄

DNA的結(jié)構(gòu)

主條目:脫氧核糖核酸

DNA通常是一個(gè)雙鏈的結(jié)構(gòu),兩條單鏈互相盤繞從而表現(xiàn)出雙螺旋結(jié)構(gòu)。脫氧核糖核苷酸是DNA的單體。DNA的每一條單鏈都是由四種堿基不同的脫氧核糖核苷酸構(gòu)成的,這四種堿基即:腺嘌呤A)、胞嘧啶C)、鳥嘌呤G)和胸腺嘧啶T)。一個(gè)核苷酸可以是一磷酸、二磷酸或者三磷酸的,也就是說(shuō),一個(gè)脫氧核糖連接著一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)磷酸基團(tuán)。每條單鏈中相鄰的脫氧核糖核苷酸都通過(guò)化學(xué)反應(yīng)生成磷酸二酯鍵相連接,以此形成了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中由磷酸基團(tuán)和脫氧核糖組成的骨架,而骨架里面既是堿基對(duì)。兩條單鏈之間的核苷(即堿基)通過(guò)氫鍵形成堿基對(duì)相連。一般情況下,A只與T相連,而C只與G相連。

DNA鏈?zhǔn)蔷哂蟹较蛐缘模瑢?duì)于DNA的一條單鏈來(lái)說(shuō),它的兩個(gè)末端分別被命名為“3'端”和“5'端”。DNA兩條單鏈的結(jié)構(gòu)之所以被描述為“反向平行雙螺旋”,其中的“反向”即指兩條單鏈中,一條鏈的方向是從3'端到5'端,而另一條則相反,是從5’端到3’端。5和3指的是在一個(gè)脫氧核糖中連接著相鄰的磷酸基團(tuán)的兩個(gè)碳原子。方向性對(duì)于DNA合成有重要的意義,因?yàn)樵贒NA合成的過(guò)程中,DNA聚合酶只能向3'端的方向添加新的脫氧核糖核苷酸。

DNA中兩條鏈的堿基是通過(guò)氫鍵連接實(shí)現(xiàn)一一配對(duì)的,這意味著一個(gè)DNA中的兩條單鏈都包含著完全相同的信息。這樣,一條單鏈中的核苷酸可以用來(lái)重建互補(bǔ)鏈中預(yù)期相對(duì)的核苷酸。

DNA聚合酶

主條目:DNA聚合酶
DNA聚合酶在一條鏈的5'端添加核苷酸.如果意外地出現(xiàn)了一個(gè)錯(cuò)配,那么DNA聚合酶將會(huì)停止繼續(xù)合成DNA。校正機(jī)制會(huì)移去錯(cuò)配的核苷酸,之后繼續(xù)合成DNA。

在所有形式的DNA復(fù)制中,DNA聚合酶都是必需的一類酶。不過(guò),一個(gè)DNA聚合酶只能根據(jù)模板鏈,延長(zhǎng)已經(jīng)存在的DNA鏈,并不能直接開始合成一條新鏈以起始DNA復(fù)制。要起始DNA復(fù)制,必須先合成一小段與模板鏈配對(duì)的,被稱之為引物的DNA或者RNA鏈。
之后,DNA聚合酶會(huì)通過(guò)磷酸二酯鍵的連接,添加與模板鏈配對(duì)的核苷酸,從而向引物鏈的3'端方向合成DNA。每一個(gè)未結(jié)合的堿基都連著三個(gè)磷酸基,DNA合成的能量即來(lái)自于其中的兩個(gè)磷酸基。(自由的堿基和與之相連的磷酸基團(tuán)統(tǒng)稱為三磷酸核苷)當(dāng)一個(gè)核苷酸被添加到正在延長(zhǎng)的DNA鏈上時(shí),它的兩個(gè)磷酸基團(tuán)將脫落,釋放的能量將會(huì)生成一個(gè)磷酸二酯鍵把剩下的磷酸基團(tuán)和DNA鏈連接起來(lái)。這樣的能量機(jī)制也可以用來(lái)解釋復(fù)制的方向性——如果DNA是從5'端向3'端合成的話,那么能量就會(huì)通過(guò)5'端提供而不是自由的核苷酸了。

一般來(lái)說(shuō),DNA聚合酶是相當(dāng)精準(zhǔn)的,每添加10^7個(gè)核苷酸,發(fā)生的錯(cuò)誤不超過(guò)一個(gè)。即使是這樣,有些DNA聚合酶也具有校正的能力,他們可以移除錯(cuò)配的堿基。如果5'端核苷酸在校正的過(guò)程中需要被移除,那么三磷酸末端就會(huì)丟失。因此,用于提供添加新核苷酸的能量來(lái)源也就丟失了。!

預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)

DNA復(fù)制是透過(guò)名為半保留復(fù)制的機(jī)制來(lái)得以順利完成的。半保留復(fù)制是由沃森克里克所預(yù)測(cè),并且由馬修·梅塞爾森(Matthew Meselson)和富蘭克林·斯塔爾(Franklin Stahl)于1958年進(jìn)行研究而得以證實(shí)。

預(yù)測(cè)

沃森和克里克在提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時(shí)就對(duì)DNA的復(fù)制過(guò)程進(jìn)行了預(yù)測(cè)。由于DNA堿基對(duì)的配對(duì)原則,兩條鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的,因此,雙鏈中的任意一條鏈都含有完整的遺傳信息。沃森和克里克推測(cè),在DNA復(fù)制過(guò)程中氫鍵首先斷裂,雙螺旋解旋并被分開,每條鏈分別作為模板各自合成一條新的互補(bǔ)鏈。這樣就產(chǎn)生了兩個(gè)與原來(lái)DNA分子的堿基順序一樣的新的DNA分子。而新DNA分子的一條鏈來(lái)自親代DNA分子,另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模虼?,這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。

實(shí)驗(yàn)

1958年,馬修·梅塞爾森(Matthew Meselson)和富蘭克林·斯塔爾(Franklin Stahl)用同位素標(biāo)記法和氯化銫密度梯度離心法證明了沃森和克里克的半保留復(fù)制模型。這個(gè)實(shí)驗(yàn)被稱作梅塞爾森-斯達(dá)爾實(shí)驗(yàn)。

過(guò)程

復(fù)制可以分為以下幾個(gè)階段:

最后DNA新合成的片段在旋轉(zhuǎn)酶的幫助下重新形成螺旋狀。

起始

細(xì)胞若要分裂,必先復(fù)制其DNA。這個(gè)過(guò)程在DNA上的一個(gè)特殊位點(diǎn)上開始,稱之為“起始位點(diǎn),相關(guān)的酶作用于這個(gè)位點(diǎn),DNA的雙鏈被分開,復(fù)制隨即開始。起始位點(diǎn)包含一段可以被復(fù)制啟動(dòng)蛋白(比如大腸桿菌中的dnaA以及酵母菌中的起始點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物)識(shí)別的DNA序列。這些啟動(dòng)蛋白吸引其他的蛋白質(zhì)把DNA的雙鏈打開并開啟復(fù)制叉。

啟動(dòng)蛋白吸引其他相關(guān)蛋白組成了前復(fù)制復(fù)合物,它可以在起始位點(diǎn)打開DNA鏈并形成一個(gè)泡。起始位點(diǎn)的序列傾向于富含A-T堿基對(duì),這有益于啟動(dòng)的實(shí)現(xiàn),因?yàn)锳-T堿基對(duì)只有兩條氫鍵相連(C-G堿基對(duì)有三個(gè)),一般來(lái)說(shuō),這樣的結(jié)構(gòu)使得打開雙鏈更加容易,因?yàn)闅滏I的數(shù)量越多則打斷它們需要的能量也越多。

所有已知的DNA復(fù)制系統(tǒng)在復(fù)制開始前都需要一個(gè)自由的3'羥基?,F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)四種不同的復(fù)制機(jī)制。

  1. 所有的真核生物、許多DNA病毒、噬菌體和質(zhì)粒用引物酶合成一小段包含有一個(gè)自由3'羥基的RNA引物,DNA聚合酶隨后會(huì)順著3'羥基延長(zhǎng)序列。
  2. 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(包括反轉(zhuǎn)錄病毒)在反轉(zhuǎn)錄酶的輔作用下利用轉(zhuǎn)移RNA為DNA的復(fù)制延伸提供自由 3′ OH。
  3. 在腺病毒和細(xì)菌噬菌體 φ29家族中,DNA聚合酶將核苷酸添加到基因組附蛋白以合成新鏈,組成基因組附蛋白的氨基酸側(cè)鏈提供 3' OH。
  4. 在單鏈DNA病毒(包括環(huán)狀病毒、雙粒病毒、細(xì)小病毒以及其他單鏈DNA病毒)、許多噬菌體和質(zhì)粒中,采用環(huán)狀復(fù)制機(jī)制(RCR)。RCR內(nèi)切酶先在基因鏈上(對(duì)于單鏈病毒)或者DNA的一條鏈上(對(duì)于質(zhì)粒)制造一個(gè)缺口。缺口鏈的5'端被運(yùn)送到核酸酶的酪氨酸殘基上,而自由的3'羥基端則被用作DNA聚合酶復(fù)制新鏈的起點(diǎn)。

這些機(jī)制中被了解最深入的是真核生物的復(fù)制機(jī)制。DNA首先解開螺旋,雙鏈被打開,RNA引物與模板鏈結(jié)合。特別來(lái)說(shuō),前導(dǎo)鏈的活動(dòng)區(qū)域只結(jié)合一個(gè)RNA引物;而后隨鏈則結(jié)合幾個(gè),這幾個(gè)RNA引物生成的斷斷續(xù)續(xù)的后隨鏈稱之為岡崎片段,以其發(fā)現(xiàn)者命名。

DNA聚合酶在合成前導(dǎo)鏈時(shí)是持續(xù)合成的,而在后隨鏈時(shí)卻是不連續(xù)合成的(這是因?yàn)楹铣傻姆较蛐?,?qǐng)參考岡崎片段)。RNA水解酶(RNase)會(huì)水解那些曾用于使DNA聚合酶起始復(fù)制的RNA片段,另一些DNA聚合酶會(huì)進(jìn)去缺口并生成DNA填補(bǔ)缺口。當(dāng)這一步完成時(shí),前導(dǎo)鏈的一個(gè)缺口和后隨鏈的數(shù)個(gè)缺口都會(huì)被填補(bǔ)上。DNA連接酶將會(huì)填補(bǔ)這些缺口,從而完成新DNA分子的合成。

古菌、真核生物在這個(gè)過(guò)程中使用的引物酶,和細(xì)菌使用的有所不同。細(xì)菌用的引發(fā)酶屬于DnG蛋白質(zhì)超家族含有一個(gè)TOPRIM折疊型的催化域。TOPRIM折疊包含一個(gè)α/β核心和四條保守鏈,以羅斯曼拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)存在。這種結(jié)構(gòu)同時(shí)在許多酶的催化結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn),如拓?fù)洚悩?gòu)酶 I a,拓?fù)洚悩?gòu)酶II,OLD家族核酸酶,與RecR蛋白有關(guān)的DNA修復(fù)蛋白。

比較而言,古菌和真核生物中的引發(fā)酶含有高度派生的RNA識(shí)別模式。這種引發(fā)酶在結(jié)構(gòu)上和許多參與DNA復(fù)制與修復(fù)的酶相似,如:依賴于RNA的RNA聚合酶,反轉(zhuǎn)錄酶,核苷酸生成循環(huán)酶,A/B/Y家族的DNA聚合酶。所有這些蛋白質(zhì)共有一個(gè)催化機(jī)制:雙向金屬離子介導(dǎo)的核苷酸轉(zhuǎn)移,其中在第一條鏈末端和RRM-LIKE單位的第二條鏈和第三條鏈之間分別附著著兩個(gè)酸性核酸殘基,由二價(jià)陽(yáng)離子螯合

隨著DNA合成的繼續(xù),原始DNA鏈繼續(xù)沿復(fù)制泡兩邊解旋,形成具有兩個(gè)叉子的復(fù)制叉結(jié)構(gòu)。在細(xì)菌的環(huán)形染色體上只有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn),復(fù)制過(guò)程最終形成一個(gè)θ結(jié)構(gòu)。比較起來(lái),真核生物具有較長(zhǎng)的線性染色體,可在多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制起始。

復(fù)制叉

圖為復(fù)制叉。圖解:a為模板DNA;b為前進(jìn)股、c為延遲股、d為復(fù)制叉、e為引子、f為岡崎片段。 復(fù)制叉是細(xì)胞核內(nèi)DNA復(fù)制時(shí)形成的結(jié)構(gòu)。這是由解旋酶創(chuàng)造的,解旋酶用來(lái)打斷連接兩條DNA鏈的氫鍵。復(fù)制叉有兩個(gè)由DNA單鏈組成的“叉子”。這兩條打開的單鏈將會(huì)作為前導(dǎo)鏈和后隨鏈的模板,前導(dǎo)鏈和后隨鏈將會(huì)由DNA聚合酶按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則依照模板鏈合成。模板鏈的信息可以被嚴(yán)格地復(fù)制到前導(dǎo)鏈和后隨鏈上。

前導(dǎo)鏈

合成后的前導(dǎo)鏈作為新DNA的模板鏈,所以復(fù)制叉沿3'向5'移動(dòng)。從而使新合成的鏈與原始鏈互補(bǔ),在新鏈沿著5'到3'合成DNA,這和復(fù)制叉移動(dòng)的方向相同。
在前導(dǎo)鏈上,一個(gè)聚合酶不斷地“閱讀”被復(fù)制的DNA并向前導(dǎo)鏈添加核苷酸。這個(gè)聚合酶就是原核生物中的DNA聚合酶Ⅲ(DNA Pol III);在酵母菌中,推測(cè)是聚合酶ε。在人體細(xì)胞中,前導(dǎo)鏈和后隨鏈在細(xì)胞核中是由聚合酶α和聚合酶δ合成,在線粒體中由聚合酶 γ合成。在特殊情況下聚合酶ε可以替代聚合酶δ。

后隨鏈

后隨鏈?zhǔn)切翫NA雙鏈的編碼鏈,所以復(fù)制叉沿5'向3'移動(dòng)。因?yàn)樗姆较蛐院虳NA聚合酶Ⅲ從3'到5'的工作方向相反,復(fù)制過(guò)程在后隨鏈上比前導(dǎo)鏈更為復(fù)雜。
在后隨鏈上,引物酶“讀”DNA并添加數(shù)小段分開的RNA引物。在真核生物中引物酶是聚合酶α。DNA聚合酶Ⅲ或聚合酶δ延長(zhǎng)引物片段,形成岡崎片段。之后引物的去除也由聚合酶α完成。而在原核細(xì)胞中,DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymerase I)將RNA引物去除后再用對(duì)應(yīng)的脫氧核糖核苷酸替換。最后DNA連接酶再將片段連接起來(lái)。 ko

參考文獻(xiàn)


參考來(lái)源

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