DNA復(fù)制
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DNA復(fù)制是指DNA雙鏈在細(xì)胞分裂分裂間期進(jìn)行的以一個(gè)親代DNA分子為模板合成子代DNA鏈的過(guò)程。復(fù)制的結(jié)果是一條雙鏈變成兩條一樣的雙鏈（如果復(fù)制過(guò)程正常的話），每條雙鏈都與原來(lái)的雙鏈一樣（排除突變等不定因素）。
DNA復(fù)制是一種在所有的生物體內(nèi)都會(huì)發(fā)生的生物學(xué)過(guò)程，是生物遺傳的基礎(chǔ)。對(duì)于雙鏈DNA，即絕大部分生物體內(nèi)的DNA來(lái)說(shuō)，在正常情況下，這個(gè)過(guò)程開始于一個(gè)親代DNA分子,最后產(chǎn)生出兩個(gè)相同的子代DNA分子。親代雙鏈DNA分子的每一條單鏈都被作為模板，用以合成新的互補(bǔ)單鏈，這一過(guò)程被稱為半保留復(fù)制。細(xì)胞的校正機(jī)制確保了DNA復(fù)制近乎完美的準(zhǔn)確性。
在細(xì)胞當(dāng)中，DNA復(fù)制起始于基因組的特殊位點(diǎn)，稱為“起始位點(diǎn)”。起始于起始位點(diǎn)的DNA解鏈和新鏈的合成會(huì)形成復(fù)制叉。除了DNA聚合酶外，一些酶通過(guò)添加和模板相配的核苷酸來(lái)合成新DNA,一些和復(fù)制叉連接的其他蛋白對(duì)DNA的復(fù)制起始和延伸起輔助作用。
DNA復(fù)制也可以在體外（即人工地）進(jìn)行，從細(xì)胞中分離的DNA聚合酶和人造的DNA復(fù)制引物可以用來(lái)啟動(dòng)以已知序列的DNA分子為模板的復(fù)制，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種常見的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，這種采用了循環(huán)方式的人工合成，在一個(gè)DNA池中擴(kuò)增出特定的DNA片段。
此時(shí)，原本呈雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈已經(jīng)打開，并且每一條單鏈都作為下一條新鏈的模板。各個(gè)核苷酸按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則被合成新的堿基對(duì)。
目錄 |
DNA的結(jié)構(gòu)
DNA通常是一個(gè)雙鏈的結(jié)構(gòu)，兩條單鏈互相盤繞從而表現(xiàn)出雙螺旋結(jié)構(gòu)。脫氧核糖核苷酸是DNA的單體。DNA的每一條單鏈都是由四種堿基不同的脫氧核糖核苷酸構(gòu)成的，這四種堿基即：腺嘌呤（A)、胞嘧啶（C)、鳥嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）。一個(gè)核苷酸可以是一磷酸、二磷酸或者三磷酸的，也就是說(shuō)，一個(gè)脫氧核糖連接著一個(gè)、兩個(gè)或者三個(gè)磷酸基團(tuán)。每條單鏈中相鄰的脫氧核糖核苷酸都通過(guò)化學(xué)反應(yīng)生成磷酸二酯鍵相連接，以此形成了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中由磷酸基團(tuán)和脫氧核糖組成的骨架，而骨架里面既是堿基對(duì)。兩條單鏈之間的核苷（即堿基）通過(guò)氫鍵形成堿基對(duì)相連。一般情況下，A只與T相連，而C只與G相連。
DNA鏈?zhǔn)蔷哂蟹较蛐缘模瑢?duì)于DNA的一條單鏈來(lái)說(shuō)，它的兩個(gè)末端分別被命名為“3'端”和“5'端”。DNA兩條單鏈的結(jié)構(gòu)之所以被描述為“反向平行雙螺旋”，其中的“反向”即指兩條單鏈中，一條鏈的方向是從3'端到5'端，而另一條則相反，是從5’端到3’端。5和3指的是在一個(gè)脫氧核糖中連接著相鄰的磷酸基團(tuán)的兩個(gè)碳原子。方向性對(duì)于DNA合成有重要的意義，因?yàn)樵贒NA合成的過(guò)程中，DNA聚合酶只能向3'端的方向添加新的脫氧核糖核苷酸。
DNA中兩條鏈的堿基是通過(guò)氫鍵連接實(shí)現(xiàn)一一配對(duì)的，這意味著一個(gè)DNA中的兩條單鏈都包含著完全相同的信息。這樣，一條單鏈中的核苷酸可以用來(lái)重建互補(bǔ)鏈中預(yù)期相對(duì)的核苷酸。
DNA聚合酶
在所有形式的DNA復(fù)制中，DNA聚合酶都是必需的一類酶。不過(guò)，一個(gè)DNA聚合酶只能根據(jù)模板鏈，延長(zhǎng)已經(jīng)存在的DNA鏈，并不能直接開始合成一條新鏈以起始DNA復(fù)制。要起始DNA復(fù)制，必須先合成一小段與模板鏈配對(duì)的，被稱之為引物的DNA或者RNA鏈。
之后，DNA聚合酶會(huì)通過(guò)磷酸二酯鍵的連接，添加與模板鏈配對(duì)的核苷酸，從而向引物鏈的3'端方向合成DNA。每一個(gè)未結(jié)合的堿基都連著三個(gè)磷酸基，DNA合成的能量即來(lái)自于其中的兩個(gè)磷酸基。（自由的堿基和與之相連的磷酸基團(tuán)統(tǒng)稱為三磷酸核苷）當(dāng)一個(gè)核苷酸被添加到正在延長(zhǎng)的DNA鏈上時(shí)，它的兩個(gè)磷酸基團(tuán)將脫落，釋放的能量將會(huì)生成一個(gè)磷酸二酯鍵把剩下的磷酸基團(tuán)和DNA鏈連接起來(lái)。這樣的能量機(jī)制也可以用來(lái)解釋復(fù)制的方向性——如果DNA是從5'端向3'端合成的話，那么能量就會(huì)通過(guò)5'端提供而不是自由的核苷酸了。
一般來(lái)說(shuō)，DNA聚合酶是相當(dāng)精準(zhǔn)的，每添加10^7個(gè)核苷酸，發(fā)生的錯(cuò)誤不超過(guò)一個(gè)。即使是這樣，有些DNA聚合酶也具有校正的能力，他們可以移除錯(cuò)配的堿基。如果5'端核苷酸在校正的過(guò)程中需要被移除，那么三磷酸末端就會(huì)丟失。因此，用于提供添加新核苷酸的能量來(lái)源也就丟失了。!
預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)
DNA復(fù)制是透過(guò)名為半保留復(fù)制的機(jī)制來(lái)得以順利完成的。半保留復(fù)制是由沃森與克里克所預(yù)測(cè)，并且由馬修·梅塞爾森（Matthew Meselson）和富蘭克林·斯塔爾（Franklin Stahl）于1958年進(jìn)行研究而得以證實(shí)。
預(yù)測(cè)
沃森和克里克在提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時(shí)就對(duì)DNA的復(fù)制過(guò)程進(jìn)行了預(yù)測(cè)。由于DNA堿基對(duì)的配對(duì)原則，兩條鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，因此，雙鏈中的任意一條鏈都含有完整的遺傳信息。沃森和克里克推測(cè)，在DNA復(fù)制過(guò)程中氫鍵首先斷裂，雙螺旋解旋并被分開，每條鏈分別作為模板各自合成一條新的互補(bǔ)鏈。這樣就產(chǎn)生了兩個(gè)與原來(lái)DNA分子的堿基順序一樣的新的DNA分子。而新DNA分子的一條鏈來(lái)自親代DNA分子，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模虼?，這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。
實(shí)驗(yàn)
1958年，馬修·梅塞爾森（Matthew Meselson）和富蘭克林·斯塔爾（Franklin Stahl）用同位素標(biāo)記法和氯化銫密度梯度離心法證明了沃森和克里克的半保留復(fù)制模型。這個(gè)實(shí)驗(yàn)被稱作梅塞爾森-斯達(dá)爾實(shí)驗(yàn)。
過(guò)程
復(fù)制可以分為以下幾個(gè)階段：
- 起始階段：DNA解旋酶在局部展開雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA分子為單鏈，引物酶辨認(rèn)起始位點(diǎn)，以解開的一段DNA為模板，按照5'到3'方向合成RNA短鏈。形成RNA引物。
- DNA片段的生成：在引物提供了3'-OH末端的基礎(chǔ)上，DNA聚合酶催化DNA的兩條鏈同時(shí)進(jìn)行復(fù)制過(guò)程，由于復(fù)制過(guò)程只能由5'->3'方向合成，因此一條鏈能夠連續(xù)合成，另一條鏈分段合成，其中每一段短鏈成為岡崎片段（Okazaki fragments）。
- RNA引物的水解：當(dāng)DNA合成一定長(zhǎng)度后，DNA聚合酶水解RNA引物，補(bǔ)填缺口。
- DNA連接酶將DNA片段連接起來(lái)，形成完整的DNA分子。
最后DNA新合成的片段在旋轉(zhuǎn)酶的幫助下重新形成螺旋狀。
起始
細(xì)胞若要分裂，必先復(fù)制其DNA。這個(gè)過(guò)程在DNA上的一個(gè)特殊位點(diǎn)上開始，稱之為“起始位點(diǎn)，相關(guān)的酶作用于這個(gè)位點(diǎn)，DNA的雙鏈被分開，復(fù)制隨即開始。起始位點(diǎn)包含一段可以被復(fù)制啟動(dòng)蛋白（比如大腸桿菌中的dnaA以及酵母菌中的起始點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物）識(shí)別的DNA序列。這些啟動(dòng)蛋白吸引其他的蛋白質(zhì)把DNA的雙鏈打開并開啟復(fù)制叉。
啟動(dòng)蛋白吸引其他相關(guān)蛋白組成了前復(fù)制復(fù)合物，它可以在起始位點(diǎn)打開DNA鏈并形成一個(gè)泡。起始位點(diǎn)的序列傾向于富含A-T堿基對(duì)，這有益于啟動(dòng)的實(shí)現(xiàn)，因?yàn)锳-T堿基對(duì)只有兩條氫鍵相連（C-G堿基對(duì)有三個(gè)），一般來(lái)說(shuō)，這樣的結(jié)構(gòu)使得打開雙鏈更加容易，因?yàn)闅滏I的數(shù)量越多則打斷它們需要的能量也越多。
所有已知的DNA復(fù)制系統(tǒng)在復(fù)制開始前都需要一個(gè)自由的3'羥基?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)四種不同的復(fù)制機(jī)制。
- 所有的真核生物、許多DNA病毒、噬菌體和質(zhì)粒用引物酶合成一小段包含有一個(gè)自由3'羥基的RNA引物，DNA聚合酶隨后會(huì)順著3'羥基延長(zhǎng)序列。
- 反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（包括反轉(zhuǎn)錄病毒）在反轉(zhuǎn)錄酶的輔作用下利用轉(zhuǎn)移RNA為DNA的復(fù)制延伸提供自由 3′ OH。
- 在腺病毒和細(xì)菌噬菌體 φ29家族中，DNA聚合酶將核苷酸添加到基因組附蛋白以合成新鏈，組成基因組附蛋白的氨基酸側(cè)鏈提供 3' OH。
- 在單鏈DNA病毒（包括環(huán)狀病毒、雙粒病毒、細(xì)小病毒以及其他單鏈DNA病毒）、許多噬菌體和質(zhì)粒中，采用環(huán)狀復(fù)制機(jī)制（RCR）。RCR內(nèi)切酶先在基因鏈上（對(duì)于單鏈病毒）或者DNA的一條鏈上(對(duì)于質(zhì)粒）制造一個(gè)缺口。缺口鏈的5'端被運(yùn)送到核酸酶的酪氨酸殘基上，而自由的3'羥基端則被用作DNA聚合酶復(fù)制新鏈的起點(diǎn)。
這些機(jī)制中被了解最深入的是真核生物的復(fù)制機(jī)制。DNA首先解開螺旋，雙鏈被打開，RNA引物與模板鏈結(jié)合。特別來(lái)說(shuō)，前導(dǎo)鏈的活動(dòng)區(qū)域只結(jié)合一個(gè)RNA引物；而后隨鏈則結(jié)合幾個(gè)，這幾個(gè)RNA引物生成的斷斷續(xù)續(xù)的后隨鏈稱之為岡崎片段，以其發(fā)現(xiàn)者命名。
DNA聚合酶在合成前導(dǎo)鏈時(shí)是持續(xù)合成的，而在后隨鏈時(shí)卻是不連續(xù)合成的（這是因?yàn)楹铣傻姆较蛐?，?qǐng)參考岡崎片段）。RNA水解酶（RNase）會(huì)水解那些曾用于使DNA聚合酶起始復(fù)制的RNA片段,另一些DNA聚合酶會(huì)進(jìn)去缺口并生成DNA填補(bǔ)缺口。當(dāng)這一步完成時(shí)，前導(dǎo)鏈的一個(gè)缺口和后隨鏈的數(shù)個(gè)缺口都會(huì)被填補(bǔ)上。DNA連接酶將會(huì)填補(bǔ)這些缺口，從而完成新DNA分子的合成。
古菌、真核生物在這個(gè)過(guò)程中使用的引物酶，和細(xì)菌使用的有所不同。細(xì)菌用的引發(fā)酶屬于DnG蛋白質(zhì)超家族含有一個(gè)TOPRIM折疊型的催化域。TOPRIM折疊包含一個(gè)α/β核心和四條保守鏈，以羅斯曼拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)存在。這種結(jié)構(gòu)同時(shí)在許多酶的催化結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)，如拓?fù)洚悩?gòu)酶 I a,拓?fù)洚悩?gòu)酶II,OLD家族核酸酶，與RecR蛋白有關(guān)的DNA修復(fù)蛋白。
比較而言，古菌和真核生物中的引發(fā)酶含有高度派生的RNA識(shí)別模式。這種引發(fā)酶在結(jié)構(gòu)上和許多參與DNA復(fù)制與修復(fù)的酶相似，如：依賴于RNA的RNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶，核苷酸生成循環(huán)酶，A/B/Y家族的DNA聚合酶。所有這些蛋白質(zhì)共有一個(gè)催化機(jī)制：雙向金屬離子介導(dǎo)的核苷酸轉(zhuǎn)移，其中在第一條鏈末端和RRM-LIKE單位的第二條鏈和第三條鏈之間分別附著著兩個(gè)酸性核酸殘基，由二價(jià)陽(yáng)離子螯合。
隨著DNA合成的繼續(xù)，原始DNA鏈繼續(xù)沿復(fù)制泡兩邊解旋，形成具有兩個(gè)叉子的復(fù)制叉結(jié)構(gòu)。在細(xì)菌的環(huán)形染色體上只有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)，復(fù)制過(guò)程最終形成一個(gè)θ結(jié)構(gòu)。比較起來(lái)，真核生物具有較長(zhǎng)的線性染色體，可在多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制起始。
復(fù)制叉
前導(dǎo)鏈
合成后的前導(dǎo)鏈作為新DNA的模板鏈，所以復(fù)制叉沿3'向5'移動(dòng)。從而使新合成的鏈與原始鏈互補(bǔ)，在新鏈沿著5'到3'合成DNA，這和復(fù)制叉移動(dòng)的方向相同。
在前導(dǎo)鏈上，一個(gè)聚合酶不斷地“閱讀”被復(fù)制的DNA并向前導(dǎo)鏈添加核苷酸。這個(gè)聚合酶就是原核生物中的DNA聚合酶Ⅲ（DNA Pol III）；在酵母菌中，推測(cè)是聚合酶ε。在人體細(xì)胞中，前導(dǎo)鏈和后隨鏈在細(xì)胞核中是由聚合酶α和聚合酶δ合成，在線粒體中由聚合酶 γ合成。在特殊情況下聚合酶ε可以替代聚合酶δ。
后隨鏈
后隨鏈?zhǔn)切翫NA雙鏈的編碼鏈，所以復(fù)制叉沿5'向3'移動(dòng)。因?yàn)樗姆较蛐院虳NA聚合酶Ⅲ從3'到5'的工作方向相反，復(fù)制過(guò)程在后隨鏈上比前導(dǎo)鏈更為復(fù)雜。
在后隨鏈上，引物酶“讀”DNA并添加數(shù)小段分開的RNA引物。在真核生物中引物酶是聚合酶α。DNA聚合酶Ⅲ或聚合酶δ延長(zhǎng)引物片段，形成岡崎片段。之后引物的去除也由聚合酶α完成。而在原核細(xì)胞中，DNA聚合酶Ⅰ（DNA polymerase I）將RNA引物去除后再用對(duì)應(yīng)的脫氧核糖核苷酸替換。最后DNA連接酶再將片段連接起來(lái)。 ko
參考文獻(xiàn)
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參考來(lái)源
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