轉(zhuǎn)染

{{百科小圖片|bkgie.jpg|[[轉(zhuǎn)染]]}}轉(zhuǎn)染 （transfection）采用與[[質(zhì)粒]]DNA轉(zhuǎn)化[[受體]][[細(xì)胞]]相似的方法，即[[宿主]]菌先經(jīng)過CaCl2，[[電穿孔]]等處理成[[感受態(tài)]][[細(xì)菌]]，再將[[重組]][[噬菌體]]DNA直接導(dǎo)入受體細(xì)胞，進(jìn)入感受態(tài)細(xì)菌的噬菌體DNA可以同樣復(fù)制和繁殖，這種方式稱為轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式。

==簡(jiǎn)介==
轉(zhuǎn)染(transfection)指[[真核細(xì)胞]]由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過程。{{百科小圖片|bkgif.jpg|[[細(xì)胞化學(xué)]]轉(zhuǎn)染}}常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主[[染色體]]中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于[[啟動(dòng)子]]和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，[[超螺旋]]質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如[[熒光蛋白]]，β[[半乳糖苷酶]]等來幫助檢測(cè)。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基[[轉(zhuǎn)移酶]]（APH；[[新霉素抗性基因]]），[[潮霉素B]][[磷酸轉(zhuǎn)移酶]]（HPH），[[胸苷激酶]]（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的[[同源]][[細(xì)胞系]]。

轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染[[試劑]]比例，細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等?！　?==分類==

===[[化學(xué)]]轉(zhuǎn)染法===
包括：1.DEAE-[[葡聚糖]]法，2.[[磷酸鈣]]法，3.人工[[脂質(zhì)體]]法。DEAE葡聚是最早應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑之一，DEAE-葡聚糖是陽(yáng)離子多聚物，它與帶負(fù)電的[[核酸]]結(jié)合后接近[[細(xì)胞膜]]而被攝取，用DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染{{百科小圖片|bkgig.jpg|轉(zhuǎn)染示意圖}}成功地用用于瞬時(shí)表達(dá)的研究，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不是十分可靠。磷酸鈣法是[[磷酸鈣共沉淀]]轉(zhuǎn)染法，因?yàn)樵噭┮兹〉?，價(jià)格便宜而被廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的研究，先將DNA和[[氯化鈣]]混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，最后把含有沉淀的[[混懸液]]加到培養(yǎng)的細(xì)胞上，通過細(xì)胞[[胞膜]]的[[內(nèi)吞作用]]攝入DNA。磷酸鈣似乎還通過抑制[[血清]]中和細(xì)胞內(nèi)的[[核酸酶]]活性而保護(hù)外源DNA免受降解.人工脂質(zhì)體法采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，不但可以轉(zhuǎn)染其他化學(xué)方法不易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，而且還能轉(zhuǎn)染從[[寡核苷酸]]到人工[[酵母]]染色體不同長(zhǎng)度的DNA，以及RNA,和[[蛋白質(zhì)]].此外，脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染同時(shí)適用于瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)，與以往不同的是脂質(zhì)體還可以介導(dǎo)DNA和RNA轉(zhuǎn)入動(dòng)物和人的體內(nèi)用于[[基因治療]]。人工合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后形成[[復(fù)合物]]，當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí)被內(nèi)吞成為內(nèi)體進(jìn)入[[細(xì)胞質(zhì)]]，隨后DNA復(fù)合物被釋放進(jìn)入[[細(xì)胞核]]內(nèi)，至于DNA是如何穿過[[核膜]]的，其機(jī)理目前還不十分清楚.　　
===[[物理]]方法===
包括：①[[顯微注射]]②電穿孔③[[基因槍]]等，顯微注射雖然費(fèi)力，但是非常有效的將核酸導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞核的方法。這種方法常用來制備[[轉(zhuǎn)基因動(dòng)物]]，但卻不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究。電穿孔法常用來轉(zhuǎn)染如植物[[原生質(zhì)體]]這樣的常規(guī)方法不容易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。電穿孔靠脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。導(dǎo)入的效率與脈沖的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間有關(guān)系，基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞核在體的細(xì)胞.　　
==細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)==

===實(shí)驗(yàn)?zāi)康?==
學(xué)習(xí)和掌握[[外源基因]]導(dǎo)入真核細(xì)胞的主要方法—脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。了解外源基因進(jìn)入的一般性方法，觀{{百科小圖片|bkgih.jpg|[[基因]]轉(zhuǎn)染示意圖}}測(cè)外源[[蛋白]]的表達(dá)（綠色熒光蛋白），為[[染色]]準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)材料?！　?===實(shí)驗(yàn)原理===
外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：[[電擊]]法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和[[病毒]]介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的[[穿孔]]讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法是利用包裝了外源基因的[[病毒感染]]細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度較大；病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對(duì)于細(xì)胞有較大影響；所以現(xiàn)在對(duì)于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其[[毒性]]，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和[[培養(yǎng)基]]中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。

本次實(shí)驗(yàn)采用的脂質(zhì)體是promega公司的TransFast脂質(zhì)體試劑，它是一種陽(yáng)離子脂質(zhì)體和中性脂質(zhì)體的混合物，是對(duì)于本次實(shí)驗(yàn)中采用的293T細(xì)胞優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑。"　　
===實(shí)驗(yàn)材料與器材===
（1）材料

293T細(xì)胞、MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒、DMEM培養(yǎng)基、[[鏈霉素]]/[[青霉素]]（雙抗）、FCS（小牛血清）、PBS（[[磷酸鹽]]緩沖溶液）、[[胰酶]]/EDTA消化液、轉(zhuǎn)染試劑（TransFast）

（2）器材

20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭[[酒精燈]]、廢液缸、血球計(jì)數(shù)板、渦旋[[振蕩器]]、[[恒溫]]水浴箱、臺(tái)式[[離心機(jī)]]、35mm[[培養(yǎng)皿]]、轉(zhuǎn)染管、15ml[[離心管]]、觀察用[[倒置顯微鏡]][[熒光顯微鏡]]和CCD　　
===實(shí)驗(yàn)步驟===
細(xì)胞[[傳代]]

(1)試驗(yàn)準(zhǔn)備：200ul/1mlTip頭各一盒（以上物品均需[[高壓滅菌]]），[[酒精]][[棉球]]，廢液缸，[[試管架]]，微量移液器，[[記號(hào)筆]]，培養(yǎng)皿，離心管。

(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。

(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液，[[消化]]1分鐘（37。C，5%CO2)。用手輕拍[[培養(yǎng)瓶]]壁，觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來為止。

(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

(5)用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開。

(6)將[[培養(yǎng)液]]裝入離心管中，1000rpm離心5min。

(7)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，[[細(xì)胞計(jì)數(shù)]]后選擇0.8X106個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)mm培養(yǎng)皿。

(8)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。

(9)將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2[[培養(yǎng)箱]]中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1）轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備

A.將400ul[[去核]]酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

B.震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩，。

2）選擇合適的混合比例（1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量）來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的[[無血清培養(yǎng)基]]。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。

5）將混合液在室溫放置10-15分鐘。

6)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。

7）加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。

8）到時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24－48小時(shí)。

第二次細(xì)胞傳代

1） 在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

2） 再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照[[免疫]]染色合適的密度0.8X105個(gè)細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新粉入培養(yǎng)皿中。

3） 在正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)后按照染色要求條件固定?！　?==研究進(jìn)展==

===轉(zhuǎn)染技術(shù)===
國(guó)際上推出了一些陽(yáng)離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，以其適用宿主范圍廣，操作簡(jiǎn)便，對(duì)[[細(xì)胞毒性]]小，轉(zhuǎn)染效{{百科小圖片|bkgii.jpg|轉(zhuǎn)染試劑}}率高受到研究者們的青睞。其中樹枝狀聚合物（Dendrimers）和[[聚乙烯]][[亞胺]]（Polyethylenimine，PEI）的轉(zhuǎn)染性能最佳，但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性，且其合成工藝復(fù)雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽(yáng)離子電荷密度的有機(jī)大分子，每相隔二個(gè)碳個(gè)原子，即每“第三個(gè)原子都是質(zhì)子化的[[氨基氮]]原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”(protonsponge)體。這種聚陽(yáng)離子能將各種報(bào)告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細(xì)胞，其效果好于[[脂質(zhì)]]聚酰胺，經(jīng)進(jìn)一步的改性后，其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細(xì)胞毒性低。大量實(shí)驗(yàn)證明，PEI是非常有希望的基因治療載體。目前在設(shè)計(jì)更復(fù)雜的基因載體時(shí)，PEI經(jīng)常做為核心組成成分?！　?===轉(zhuǎn)染效率===
線型PEI（LinePEI,LPEI）與其[[衍生物]]用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI（BranchedPEI,BPEI）要早一些，過去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性較低，有利于[[細(xì)胞定位]]，因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，從而提高轉(zhuǎn)染效率，但同時(shí)細(xì)胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低，但轉(zhuǎn)染效率卻較高。 

GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有[[生理]]條件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝結(jié)構(gòu)使得其具有較高的正電性，因此易于高效地包裹各種DNA、RNA[[分子]]及質(zhì)粒形成小的納米顆粒，從而提高轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)所形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞以后，其中所含的生理?xiàng)l件下可降解的化學(xué)鍵在細(xì)胞內(nèi)水解，使交聯(lián)聚合物分解為無細(xì)胞毒性的小分子PEI，這樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染試劑在體外應(yīng)用可以獲得高的轉(zhuǎn)染效率和低的細(xì)胞毒性，其可降解性對(duì)體內(nèi)應(yīng)用也具有重要的意義。

[[分類:生物化學(xué)]][[分類:生物]][[分類:化學(xué)]][[分類:分子生物學(xué)]][[分類:遺傳學(xué)]]
{{遺傳重組}}