生物化學(xué)與分子生物學(xué)/酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)

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[[酶促反應(yīng)]]動(dòng)力學(xué)(kineticsof enzyme-catalyzed reactions)是研究酶促反應(yīng)速度及其影響因素的科學(xué)。這些因素主要包括酶的濃度、[[底物]]的濃度、pH、溫度、[[抑制劑]]和[[激活劑]]等。在研究某一因素對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響時(shí)，應(yīng)該維持反應(yīng)中其它因素不變，而只改變要研究的因素。但必須注意，酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)中所指明的速度是反應(yīng)的初速度，因?yàn)榇藭r(shí)反應(yīng)速度與酶的濃度呈正比關(guān)系，這樣避免了反應(yīng)產(chǎn)物以及其他因素的影響。

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究有助于闡明酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，也可為酶作用機(jī)理的研究提供數(shù)據(jù)；有助于尋找最有利的反應(yīng)條件，以最大限度地發(fā)揮酶[[催化]]反應(yīng)的高效率；有助于了解酶在[[代謝]]中的作用或某些[[藥物作用]]的機(jī)理等，因此對(duì)它的研究具有重要的理論意義和實(shí)踐意義。

== 一、酶濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響==

在一定的溫度和pH條件下，當(dāng)?shù)孜餄舛却蟠蟪^酶的濃度時(shí)，酶的濃度與反應(yīng)速度呈正比關(guān)系(圖2-7)。

== 二、底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響==

在酶的濃度不變的情況下，底物濃度對(duì)反應(yīng)速度影響的作用呈現(xiàn)矩形雙曲線(rectangular hyperbola)(圖2-8)。

{| class="wikitable"
|-
| |
{{圖片|gra28ux7.jpg|}}
| |
{{圖片|gra28c9b.jpg|}}
|-
| | 圖2-7 酶濃度對(duì)反應(yīng)初速度的影響
| | 圖2-8 底物濃度對(duì)反應(yīng)初速度的影響
|}

{{圖片|gra284e6.jpg|}}

在底物濃度很低時(shí)，反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而急驟加快，兩者呈正比關(guān)系，表現(xiàn)為一級(jí)反應(yīng)。隨著底物濃度的升高，反應(yīng)速度不再呈正比例加快，反應(yīng)速度增加的幅度不斷下降。如果繼續(xù)加大底物濃度，反應(yīng)速度不再增加，表現(xiàn)為0級(jí)反應(yīng)。此時(shí)，無論底物濃度增加多大，反應(yīng)速度也不再增加，說明酶已被底物所[[飽和]]。所有的酶都有飽和現(xiàn)象，只是達(dá)到飽和時(shí)所需底物濃度各不相同而已。

'''(一)米曼氏方程式'''

解釋酶促反應(yīng)中底物濃度和反應(yīng)速度關(guān)系的最合理學(xué)說是中間產(chǎn)物學(xué)說。酶首先與底物結(jié)合生成酶椀孜鋦春銜?中間產(chǎn)物)，此復(fù)合物再分解為產(chǎn)物和游離的酶。

Michaelis和Menten在前人工作的基礎(chǔ)上，經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)，1913年前后提出了反應(yīng)速度和底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即著名的米椔戲匠淌?michaelismenten equation)．

V=Vmax［S］/Km+［S］

Vmax指該酶促反應(yīng)的最大速度，［S］為底物濃度，Km是[[米氏常數(shù)]]，V是在某一底物濃度時(shí)相應(yīng)的反應(yīng)速度。當(dāng)?shù)孜餄舛群艿蜁r(shí)，［S］《Km,則V≌Vmax/Km［S］，反應(yīng)速度與底物濃度呈正比。當(dāng)?shù)孜餄舛群芨邥r(shí)，［S］》Km，此時(shí)V≌Vmax，反應(yīng)速度達(dá)最大速度，底物濃度再增高也不影響反應(yīng)速度(圖2-9)。

{{圖片|gra297tw.jpg|酶與不同濃度的底物相互作用模式}}

圖2-9 酶與不同濃度的底物相互作用模式

'''(二)米－曼氏方程式的推導(dǎo)'''

米－曼氏方程式提出后又經(jīng)riggs和Haldane的充實(shí)和發(fā)展，經(jīng)補(bǔ)充和發(fā)展的米－曼氏方程工推導(dǎo)如下：

{{圖片|gra281z8.jpg|}}(1)

式中K1、K2、K3、K4分別為各向反應(yīng)的速度常數(shù)。

從式(1)中知，ES的生成途徑來自E+S和E+P，但其中E+P生成ES的速度極小(尤其在起始階段，P的生成很少)，可以忽略不計(jì)，又因?yàn)榈孜餄舛却蟠蟪^酶的濃度，［S］》［E］，中間產(chǎn)物ES中的S濃度可以忽略不計(jì)，因此，ES的生成速度為：

{| class="wikitable"
|-
| | d［ES］
| rowspan="2" | ＝
| rowspan="2" | K1(［Et］-［ES］).［S］
| rowspan="2" | (2)
|-
| | dt
|}

其中［Et］-［ES］為[[游離酶]]的濃度，ES的分解速度為：

{| class="wikitable"
|-
| rowspan="2" | -
| | ［ES］
| rowspan="2" | =
| rowspan="2" | K2［ES］+K3［ES］=(K2+K3)［ES］
| rowspan="2" | (3)
|-
| | dt
|}

當(dāng)反應(yīng)體系處于[[穩(wěn)態(tài)]]時(shí)，ES生成和分解的速度相等，即

K1(［Et］-［ES］).［S］=(K2+K3)［ES］

{| class="wikitable"
|-
| | K2+K3
| rowspan="2" | =
| | ［Et］-［ES］
| rowspan="2" | .［S］
|-
| | K1
| | ［ES］
|}

令K2+K3／K1=Km　則　Km=［Et］-［ES］／［ES］.［S］

［ES］=［Et］［S］/Km+［S］　　　?(4)

由于反應(yīng)速度取決于產(chǎn)物P的生成量，故

V=K3［ES　　　?(5)

在酶促反應(yīng)達(dá)最大速度時(shí)，所有的酶[[分子]]都已與底物結(jié)合形成中間產(chǎn)物，此時(shí)

［Et］=［ES］　　　?(6)

那么　Vmax=K3［Et］　　　?(7)

在(4)式兩邊乘以K3得：

K3.［ES］=K3.［Et］［S］／Km+［S］　以(5)和(7)式代入，即：

V=Vmax［S］／Km+［S］

'''(三)米氏常數(shù)的意義'''

當(dāng)反應(yīng)速度為最大速度一半時(shí)，米氏方程可以變換如下：

?Vmax=Vmax［S］／Km+［S］

進(jìn)一步整理可得到：

Km=［S］

可知，Km值等于[[酶反應(yīng)]]速度為最大速度一半時(shí)的底物濃度。

因?yàn)镵m=K2+K3／K1，當(dāng)K2》K3，即ES[[解離]]成E和S的速度大大超過分離成E和P的速度時(shí)，K3可以忽略不計(jì)，此時(shí)Km值近似于ES[[解離常數(shù)]]KS，此時(shí)Km值可用來表示酶對(duì)底物的親和力。

Km=K2/K1=［E］［S］/［ES］=KS

Km值愈大，酶與底物的親和力愈小；Km值愈小，酶與底物親和力愈大。酶與底物親和力大，表示不需要很高的底物濃度，便可容易地達(dá)到最大反應(yīng)速度。但是KS值并非在所有酶促反應(yīng)中都遠(yuǎn)小于K2，所以Ks值(又稱酶促反應(yīng)的底物常數(shù))和Km值的涵義不同，不能互相代替使用。

Km值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質(zhì)，酶所催化的底物和酶促反應(yīng)條件(如溫度、pH、有無抑制劑等)有關(guān)，與酶的濃度無關(guān)。酶的種類不同，Km值不同，同一種酶與不同底物作用時(shí)，Km值也不同。各種酶的Km值范圍很廣，大致在10-1～10-6M之間。

當(dāng)K3不遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于K2和K1時(shí)，Km表示整個(gè)反應(yīng)的化學(xué)平衡的常數(shù)。

如果Km值已知，任何底物濃度時(shí)酶的飽和度(形成中間產(chǎn)物的酶占總酶的比例，saturation fraction fEs)fEs便可計(jì)算出來。

fES=［ES］／［Et］=K3［ES］／K3［Et］＝V／Vmax=［S］／Km+［S］

'''(四)Km和Vmax的求法'''

如圖2?所示，底物濃度曲線是矩形雙曲線。

從圖中很難精確地測(cè)出Km和Vmax。為此人們將米氏方程進(jìn)行種種變換，將曲線作圖轉(zhuǎn)變成直線作圖。

1.雙倒數(shù)作圖(doublereciprocal plot or LineweaverBurk plot)

將米氏方程兩邊取倒數(shù)，可轉(zhuǎn)化為下列形式：

1／V=Km／Vmax.1／［S］+1／Vmax

從圖2-10可知，1/V對(duì)1/［S］的作圖得一直線，其斜率是Km/V，在縱軸上的截距為1/Vmax,橫軸上的截距為-1/Km。此作圖除用來求Km和Vmax值外，在研究酶的抑制作用方面還有重要價(jià)值。

{{圖片|gra28pcr.jpg|雙倒數(shù)作圖法}}

圖2-10 雙倒數(shù)作圖法

{{圖片|gra28hdm.jpg|v對(duì)v/［s］作圖法}}

圖2-11 v對(duì)v/［s］作圖法

2.V對(duì)V〖〗［S］［SX)］法(EadieHofstee plot)

將米氏方程經(jīng)移項(xiàng)整理后可寫成

VKm+V［S］=Vm［S］

V［S］=Vm［S］-VKm

故V=Vm-KmV／［S］

以V為縱坐標(biāo)對(duì)V／［S］橫坐標(biāo)作圖，所得直線，其縱軸的截距為Vmax，斜率為Km(圖2-11)。

必須指出米氏方程只適用于較為簡單的酶作用過程，對(duì)于比較復(fù)雜的酶促反應(yīng)過程，如[[多酶]]體系、多底物、多產(chǎn)物、多中間物等，還不能全面地籍此概括和說明，必須借助于復(fù)雜的計(jì)算過程。

== 三、pH對(duì)反應(yīng)速度的影響==

酶反應(yīng)介質(zhì)的pH可影響酶分子，特別是活性中心上[[必需基團(tuán)]]的解離程度和催化基團(tuán)中質(zhì)子[[供體]]或[[質(zhì)子受體]]所需的離子化狀態(tài)，也可影響底物和[[輔酶]]的解離程度，從而影響酶與底物的結(jié)合。只有在特定的pH條件下，酶、底物和輔酶的解離情況，最適宜于它們互相結(jié)合，并發(fā)生催化作用，使酶促反應(yīng)速度達(dá)最大值，這種pH值稱為酶的最適pH(optimum pH)。它和酶的最穩(wěn)定pH不一定相同，和體內(nèi)環(huán)境的pH也未必相同。

{{圖片|gra28mrr.jpg|[[胃蛋白酶]]和[[葡萄糖]]-6-[[磷酸酶]]的pH活性曲線}}

圖2-12 胃蛋白酶和葡萄糖-6-磷酸酶的pH活性曲線

動(dòng)物體內(nèi)多數(shù)酶的最適pH值接近中性，但也有例外，如胃蛋白酶的最適pH約1.8，[[肝精]]氨酸酶最適pH約為9.8(見表2-2)。

表2-2 一些酶的最適pH

{| class="wikitable"
|-
| | 酶
| | 最適pH
| | 酶
| | 最適pH
| | 酶
| | 最適pH
|-
| | 胃蛋白酶
| | 1.8
| | [[過氧化氫酶]]
| | 7.6
| | [[延胡索酸酶]]
| | 7.8
|-
| | [[胰蛋白酶]]
| | 7.7
| | [[精氨酸酶]]
| | 9.8
| | [[核糖核酸酶]]
| | 7.8
|}

最適pH不是酶的特征性常數(shù)，它受底物濃度、[[緩沖液]]的種類和濃度以及酶的純度等因素的影響。

溶液的pH值高于和低于最適pH時(shí)都會(huì)使酶的活性降低，遠(yuǎn)離最適pH值時(shí)甚至導(dǎo)致酶的變性[[失活]]。測(cè)定酶的活性時(shí)，應(yīng)選用適宜的緩沖液，以保持[[酶活性]]的相對(duì)恒定。

== 四、溫度對(duì)反應(yīng)速度的影響==

化學(xué)反應(yīng)的速度隨溫度增高而加快。但酶是[[蛋白質(zhì)]]，可隨溫度的升高而變性。在溫度較低時(shí)，前一影響較大，反應(yīng)速度隨溫度升高而加快，一般地說，溫度每升高10℃，反應(yīng)速度大約增加一倍。但溫度超過一定數(shù)值后，酶受熱變性的因素占優(yōu)勢(shì)，反應(yīng)速度反而隨溫度上升而減緩，形成倒V形或倒U形曲線。在此曲線頂點(diǎn)所代表的溫度，反應(yīng)速度最大，稱為酶的最適溫度(optimum temperature)(圖2-13)。

{{圖片|gra2905l.jpg|溫度對(duì)[[唾液淀粉酶]]活性影響}}

圖2-13 溫度對(duì)唾液淀粉酶活性影響

從動(dòng)物組織提取的酶，其最適溫度多在35℃～40℃之間，溫度升高到60℃以上時(shí)，大多數(shù)酶開始變性，80℃以上，多數(shù)酶的變性不可逆。酶的活性雖然隨溫度的下降而降低，但[[低溫]]一般不破壞酶。溫度回升后，酶又恢復(fù)活性。臨床上低溫[[麻醉]]就是利用酶的這一性質(zhì)以減慢組織細(xì)胞代謝速度，提高機(jī)體對(duì)氧和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的耐受體，有利于進(jìn)行手術(shù)治療。

酶的最適溫度不是酶的特征性常數(shù)，這是因?yàn)樗c反應(yīng)所需時(shí)間有關(guān)，不是一個(gè)固定的值。酶可以在短時(shí)間內(nèi)耐受較高的溫度，相反，延長[[反應(yīng)時(shí)]]間，最適溫度便降低。

== 五、抑制劑對(duì)反應(yīng)速度的影響==

凡能使酶的活性下降而不引起[[酶蛋白]]變性的物質(zhì)稱做酶的抑制劑(inhibitor)。使酶變性失活(稱為酶的鈍化)的因素如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等，不屬于抑制劑。通常抑制作用分為可逆性抑制和不可逆性抑制兩類。

'''(一)不可逆性抑制作用(irreversibleinhibition)'''

不可逆性抑制作用的抑制劑，通常以[[共價(jià)鍵]]方式與酶的必需基團(tuán)進(jìn)行不可逆結(jié)合而使酶喪失活性，按其作用特點(diǎn)，又有[[專一性]]及非專一性之分。

1.非專一性不可逆抑制

抑制劑與酶分子中一類或幾類基團(tuán)作用，不論是必需基團(tuán)與否，皆可共價(jià)結(jié)合，由于其中必需基團(tuán)也被抑制劑結(jié)合，從而導(dǎo)致酶的失活。某些重金屬(Pb++、[[Cu]]++、Hg++)及對(duì)氯汞[[苯甲酸]]等，能與酶分子的[[巰基]]進(jìn)行不可逆適合，許多以巰基作為必需基團(tuán)的酶(通稱巰基酶)，會(huì)因此而遭受抑制，屬于此種類型。用[[二巰基丙醇]](british antilewisite,BAL)或[[二巰基丁二酸鈉]]等含巰基的[[化合物]]可使酶復(fù)活。

{{圖片|gra28js8.jpg|非專一性不可逆抑制}}

2.專一性不可逆抑制

此屬抑制劑專一地作用于酶的活性中心或其必需基團(tuán)，進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，從而抑制酶的活性。[[有機(jī)磷]]殺蟲劑能專一作用于[[膽堿酯酶]]活性中心的[[絲氨酸]][[殘基]]，使其磷[[酰化]]而不可逆抑制酶的活性。當(dāng)膽堿酯酶被有機(jī)磷殺蟲劑抑制后，[[膽堿能神經(jīng)]]末稍分泌的[[乙酰膽堿]]不能及時(shí)分解，過多的乙酰膽堿會(huì)導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)過度興奮的[[癥狀]]。[[解磷定]]等藥物可與有機(jī)磷殺蟲劑結(jié)合，使酶和有機(jī)磷[[殺蟲劑]]分離而復(fù)活。

{{圖片|gra28xmv.jpg|專一性不可逆抑制}}

'''(二)可逆性抑制(reversible inhibition)'''

抑制劑與酶以非共價(jià)鍵結(jié)合，在用[[透析]]等[[物理]]方法除去抑制劑后，酶的活性能恢復(fù)，即抑制劑與酶的結(jié)合是可逆的。這類抑制劑大致可分為以下二類。

1.[[競(jìng)爭性抑制]](competitive inhibition)

(1)含義和反應(yīng)式

抑制劑I和底物S對(duì)游離酶E的結(jié)合有競(jìng)爭作用，互相排斥，已結(jié)合底物的ES[[復(fù)合體]]，不能再結(jié)合I。同樣已結(jié)合抑制劑的EI復(fù)合體，不能再結(jié)合S。

{{圖片|gra295d1.jpg|}}

抑制劑I在[[化學(xué)]]結(jié)構(gòu)上與底物S個(gè)相似，能與底物S競(jìng)爭酶E分子活性中心的結(jié)合基團(tuán)，因此，抑制作用大小取決于抑制劑與底物的濃度比，加大底物濃度，可使抑制作用減弱。

例如，丙二酸、[[蘋果]]酸及[[草酰乙酸]]皆和[[琥珀酸]]的結(jié)構(gòu)相似，是[[琥珀酸脫氫酶]]的競(jìng)爭性抑制劑。

{{圖片|gra29dcu.jpg|}}

(2)反應(yīng)速度公式及作圖

按米氏公式推導(dǎo)方法，也可演算出競(jìng)爭性抑制時(shí)，抑制劑、底物和反應(yīng)速度之間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系及其雙倒數(shù)方程式為：

{{圖片|gra292ra.jpg|反應(yīng)速度公式及作圖}}

以1V分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)作圖，此方程式可繪成競(jìng)爭性抑制作用的特性曲線(圖2-14)。

{{圖片|gra289rg.jpg|競(jìng)爭性抑制}}

圖 2-14　競(jìng)爭性抑制

有競(jìng)爭性抑制劑存在的曲線與無抑制劑的曲線相交于縱坐標(biāo)I/Vmax處，但橫坐標(biāo)的截距，因競(jìng)爭性抑制存在變小，說明該抑制作用，并不影響酶促反應(yīng)的最大速度，而使Km值變大。

很多藥物都是酶的競(jìng)爭性抑制劑。例如[[磺胺藥]]與[[對(duì)氨基苯甲酸]]具有類似的結(jié)構(gòu)(如圖2-15)，而對(duì)[[氨基苯甲酸]]、二氫喋呤及[[谷氨酸]]是某些[[細(xì)菌]]合成[[二氫葉酸]]的原料，后者能轉(zhuǎn)變?yōu)閇[四氫葉酸]]，它是細(xì)菌合成[[核酸]]不可缺少的輔酶。由于磺胺藥是二氫葉酸[[合成酶]]的競(jìng)爭性抑制劑，進(jìn)而減少菌體內(nèi)四氫葉酸的合成，使核酸合成障礙，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。[[抗菌增效劑]]-[[甲氧芐氨嘧啶]](TMP)能特異地抑制細(xì)菌的二氫葉酸還原為四氫葉酸，故能增強(qiáng)磺胺藥的作用。

{{圖片|gra29aq1.jpg|磺胺藥物的[[抑菌]]作用}}

圖2-15 磺胺藥物的抑菌作用

2.非競(jìng)爭性抑制(non-competitive inhibition)

(1)含義和反應(yīng)式

抑制劑I和底物S與酶E的結(jié)合完全互不相關(guān)，既不排斥，也不促進(jìn)結(jié)合，抑制劑I可以和酶E結(jié)合生成EI，也可以和ES[[復(fù)合物]]結(jié)合生成ESI。底物S和酶E結(jié)合成ES后，仍可與I結(jié)合生成ESI，但一旦形成ESI復(fù)合物，再不能釋放形成產(chǎn)物P。

{{圖片|gra2871c.jpg|}}

I和S在結(jié)構(gòu)上一般無相似之處，I常與酶分子上結(jié)合基團(tuán)以外的化學(xué)基團(tuán)結(jié)合，這種結(jié)合并不影響底物和酶的結(jié)合，增加底物濃度并不能減少I對(duì)酶的抑制程度。

{{圖片|gra28ep3.jpg|非競(jìng)爭性抑制}}

圖2-16 非競(jìng)爭性抑制

(2)反應(yīng)速度公式及作圖

按米氏公式推導(dǎo)方法可演算出非競(jìng)爭性抑制時(shí)，抑制劑、底物濃度和反應(yīng)速度之間動(dòng)力學(xué)關(guān)系：

{{圖片|gra28rvy.jpg|}}

以1V分別為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)作圖，此方程式可繪成非競(jìng)爭性抑制作用的特性曲線(圖2-16)。

有非競(jìng)爭性抑制劑存在的曲線與無抑制劑存在的曲線相交于橫坐標(biāo)－1/Km處，縱坐標(biāo)截距，因非競(jìng)爭性抑制劑的存在而變大，說明該抑制作用，并不影響底物與酶的親和力，而使酶促最大反應(yīng)速度變小。

如[[賴氨酸]]是精氨酸酶的競(jìng)爭性抑制劑，而中性[[氨基酸]](如[[丙氨酸]])則是非競(jìng)爭性抑制劑。

總上所述，酶的競(jìng)爭性和非競(jìng)爭性抑制可通過雙倒數(shù)作圖加以區(qū)別。Vmax不因競(jìng)爭性抑制劑的存在而改變，Km則不因非競(jìng)爭性抑制劑的存在而改變。

== 六、激活劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響==

能使酶活性提高的物質(zhì)，都稱為激活劑(activator)，其中大部分是離子或簡單的有機(jī)化合物。如[[Mg]]++是多種[[激酶]]和合成酶的激活劑，動(dòng)物[[唾液]]中的α-[[淀粉酶]]則受Cl-的激活。
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{{生物化學(xué)與分子生物學(xué)圖書專題}}